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摘要：以黄黏土、藕塘泥、豆饼粉、大曲粉、鲜酒糟、黄浆水、酒尾、脱水活性窖泥功能菌等为原料，制备一种浓香型酒人工窖泥，通过窖泥宏基因组DNA提取，建立16SrDNA、18SrDNA文库，
然后对该窖泥16SrDNA、18SrDNA文库进行高通量测序，最后进行微生物多样性分析。
关键词：人工窖泥；制备；微生物；多样性分析
中国白酒有上千年的酿造历史，具有鲜明的地域特色，是世界六大蒸馏酒之一。
俗话说“千年窖池万年糟”、“生香靠发酵，提香靠蒸馏”，作为中国大部分白酒发酵载体的窖池，在白酒生产过程中无疑起到举足轻重的作用。酒醅在窖池中密封厌氧发酵，酒醅、少量遗留空气、窖池共同参与了这一完整发酵过程，窖池的优劣，窖泥里含有的微生物种类及丰富程度直接影响着后期蒸馏白酒的质量，优质的窖泥对白酒生产至关重要。
1材料
1.1黄黏土5.03
要求：土质较纯，含沙量低，粘度较大。
1.2藕塘泥5.03
要求：种植莲藕5年以上，塘泥无污染，无异杂物，含沙量低。
1.3豆饼粉200kg
要求：粉碎成面。
1.4大曲粉500kg
要求：中温曲，外观、指标均符合标准要求，粉碎成面。
1.5鲜酒糟500kg
要求：当日或前一日蒸酒后丢糟。
1.6黄浆水500kg
1.7浓香酒尾700kg
要求：按30%vol标准折算。
1.8专用辅料70kg
1.9脱水活性窖泥功能菌180kg
2窖泥制备
2.1脱水活性窖泥功能菌活化液的制备
在陶坛中按l：6（40°C～45°C）的温水比例，将功能菌加水活化，在28°C～35°C的条件下，保温活化4小时，在活化过程中每小时至少应搅拌一次。
2.2专业辅料液（制备方法同2.1）
2.3将粘黄土、藕塘泥打散，除去杂物，然后按配方要求做好计量，放置在窖泥制备场所。
2.4将各种固体材料混合折成堆，并翻拌均匀，然后摊平厚约30～40公分的方（圆）堆。
2.5将酒尾、黄浆水混合液（用氨水或碳酸铵调整PH6.5～6.8）和功能菌活化液，专用辅料液喷洒在堆面上，边洒边拌合，直至合熟为止，然后经打泥机第一次打泥。
2.6将合熟的混合泥运至窖泥专用发酵池旁，再次经打泥机直接打入池中，入池温度控制在30°C～35°C，PH6.5～7.0。池子装泥量应低于池口沿20～30公分为宜。
2.7入完后将池口泥扒平，表面洒入含1.5%vol的酒液8～10公斤作为液封。上面盖好塑料布，周边用土压实，进行厌氧发酵30～40天。
3微生物多样性分析
3.1实验目的
对窖泥样本进行miseq文库制备（基因组DNA抽提、PCR扩增，AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收，及FTC-3000TM real-time PCR仪）。而后进行illumina miseq 2x300 bp 高通量测序及生物信息学分析。
3.2原核微生物项目结果报告
3.2.1测序数据统计
3.2.2多样性指数分析结果统计
3.2.3稀释性曲线
3.2.4窖泥原核微生物分析
通过窖泥宏基因组DNA提取，并建立16SrDNA 文库，然后对该窖泥16SrDNA 文库进行高通量测序。测序有效序列条数为94017；获得45480个Reads，分成729个OTU。通过聚类结果可以得到该窖泥种菌群分布如下：
优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）占比98.29%，其次为放线菌和变形菌；97.65%均为梭菌纲梭菌目；继续分类，总序列的94.49%为瘤胃菌科；但是具体到菌的种和属，根据目前数据库比较，90%以上为未分类的种和属，及部分虽然能分类但属于未培养细菌。所以该窖泥具有开发新菌种及新基因序列的潜力。
根据窖泥研究文献瘤胃菌科细菌是产己酸的主要菌种，而正己酸和乙醇形成正己酸乙酯是浓香型白酒重要的香型物质；该己酸菌类未在数据库中检索到种和属，说明此窖泥可能具有独特的己酸菌菌种，可能产生自己独特风味的浓香型白酒。
3.3 真核微生物项目结果报告
3.3.1测序数据统计
3.3.2多样性指数分析结果统计
3.3.3稀释性曲线
3.3.4窖泥真核微生物分析
通过窖泥宏基因组DNA提取，建立18SrDNA 文库，然后对该窖泥18SrDNA 文库进行高通量测序。测序有效序列条数为70436；获得35282个Reads，分成883个OTU。通过聚类结果可以得到该窖泥种菌群分布如下：
真核生物比较丰富，主要集中在绿藻门37.10%、轮形动物门18.49%、链形植物门13.27%等。优势物种为Prototheca zopfii（左氏原壁菌），根据文献对窖泥的研究，该窖泥中所出现的优势真核物种对白酒酿造过程的作用未见报道。
4结论
从微生物分析的最终结果看，此次制备的浓香窖泥中，其优势菌群为厚壁菌门、梭菌纲梭菌目、瘤胃菌科，而瘤胃菌科细菌正是产己酸的主要菌种。在发酵过程中，对己酸乙酯的生成起到主要作用，而且己酸乙酯是浓香型白酒典型的香味物质。该次制备的窖泥性能的优劣，我们将在以后的生产实践中做进一步的研究。
（注：文章中的分析数据均摘自华东理工大学鲁华生物技术研究所出具的山东景阳冈酒厂有限公司窖泥微生物多样性分析报告。）
